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產品僅供研究使用，不適用于人類或臨床診斷
商品屬性：

產品英文名稱：CFDA SE Cell Proliferation and Cell Tracking Kit

產品中文名稱：CFDA SE 細胞增殖與示蹤檢測試劑盒

規格：200T×5/200T×10

貨號：EY-01X8526
用途：僅供科研研究實驗

特點&優勢:

•  CFDA SE探針可以在幾代中很好地保留在活細胞中。

•  探針會轉移到子細胞，但不轉移到群體中的相鄰細胞。

•  兼容流式細胞儀或熒光顯微鏡等檢測方法

• 實驗開始前，確保所有的組分及設備處于合適的溫度。

保存建議:收到貨后，請避光保存于-20℃。請參閱說明書中各個組件的存儲條件，自發貨之日起，按照推薦的保存條件，有效期為12個月。

運輸條件:藍冰運輸

背景

5(6)-CFDA, SE 是一種可對活細胞進行熒光標記的細胞示蹤染料，不僅可用于細胞增殖的體外實驗，還可用于追蹤細胞在體內的分裂增殖過程。5(6)-CFDA, SE 是二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，FDA）的衍生物，具有細胞膜滲透性，本身不具有熒光發光性。當通過被動運輸穿透細胞膜進入活細胞后，被胞漿內的酯酶催化生成羧基熒光素琥珀酰亞胺（carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，CFSE），可發強烈的綠色熒光，不能穿透細胞膜，能完好的保留在胞內。CFSE 還可自發并不可逆地與細胞內的氨基結合從而偶聯到細胞蛋白質上，同時過量且未被偶聯的 5(6)-CFDA, SE 通過被動擴散回到細胞外培養基內，被后續清洗步驟所清除。經 5(6)-CFDA, SE 標記的非分裂細胞的熒光非常穩定，穩定標記的時間可達數月，因此非常適用于細胞群落分析。5(6)-CFDA, SE 標記細胞的熒光非常均一，優于以前使用的其他細胞示蹤熒光探針如 PKH26，并且分裂后的子代細胞的熒光分配也很均一。在細胞分裂增殖過程中，CFSE 標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，熒光強度變為親代細胞的一半，通過流式細胞儀（FL1 通道）根據熒光強度的不同，可檢測出未分裂細胞，分裂一次（1/2 的熒光強度），二次（1/4 的熒光強度），三次（1/8 的熒光強度），以及更多分裂次數的細胞。5(6)-CFDA, SE 可檢測分裂次數多達八次甚至更多。

本產品具有下列特點:

 1.操作簡便、快捷。可直接加入到檢測平板。在96-孔板中檢測時,無需洗滌或收獲細胞,免去溶解步驟。

2. 無放射性。不需要配制液閃混合物,也不需要處理廢棄物。

3. 與MTT相比,使用更安全。不需要使用揮發性的有機溶劑來溶解甲臜產物。

4. 操作靈活,與MTT不同,平板讀數后可放回溫箱繼續孵育,使顏色進一步生成。
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IgG Protein Rabbit 重組兔 IgG-Fc 蛋白 (185 Thr/Ala, Asn 284/Ser)

操作步驟：

(一)獲得目的基因

1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。

2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

(二)構建重組表達載體

1、載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

(三)  獲得含重組表達質粒的表達菌種

1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。

2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

(四)誘導表達

1、挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。